Pwodwi yo
Twous deteksyon Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR pou 2019-nCoV
Itilizasyon espere
Twous sa a itilize pou deteksyon kalitatif nouvo kowonaviris (2019-nCoV) lè l sèvi avèk prelèvman nan gòj, prelèvman nazofarinj, likid lavaj bronchoalveolè, krache. Rezilta deteksyon pwodui sa a se sèlman pou referans klinik, epi li pa ta dwe itilize kòm sèlman prèv pou dyagnostik klinik ak tretman.Yon analiz konplè sou kondisyon an rekòmande nan konbinezon ak manifestasyon klinik pasyan an ak lòt tès laboratwa.
Prensip enspeksyon
Twous la baze sou teknoloji RT-PCR yon sèl etap.An reyalite, nouvo kowonaviris 2019 (2019-nCoV) ORF1ab ak jèn N yo te chwazi kòm rejyon sib anplifikasyon yo.Jadendanfan espesifik ak sond fliyoresan (sond jèn N yo make ak FAM ak sond ORF1ab yo make ak HEX) yo fèt pou detekte 2019 nouvo kowonaviris RNA nan echantiyon.Twous la gen ladan tou yon sistèm deteksyon kontwòl entèn andojèn (sond jèn kontwòl entèn ki make ak CY5) pou kontwole pwosesis koleksyon echantiyon, RNA ak anplifikasyon PCR, kidonk diminye fo rezilta negatif.
Konpozan prensipal yo
| Eleman | Volim（48T / Twous） |
| Solisyon reyaksyon RT-PCR | 96µl |
| nCOV primer TaqMan probemixture（ORF1ab,N Gene,RnaseP Gene） | 864µl |
| Kontwòl negatif | 1500µl |
| nCOV kontwòl pozitif (l ORF1ab N Gene) | 1500µl |
Pwòp reyaktif: RNA ekstraksyon oswa reyaktif pou pirifye.Kontwòl negatif/pozitif: Kontwòl pozitif la se RNA ki gen fragman sib la, alòske kontwòl negatif la se dlo san asid nikleyik.Pandan itilizasyon, yo ta dwe patisipe nan ekstraksyon an epi yo ta dwe konsidere kòm enfeksyon.Yo ta dwe okipe ak jete yo an akò ak règleman ki enpòtan.
Jèn referans entèn la se jèn RnaseP imen an.
Kondisyon depo ak dat ekspirasyon
-20±5 ℃, evite repete konjelasyon ak dekonjle plis pase 5 fwa, valab pou 6 mwa.
Enstriman ki aplikab
Avèk FAM / HEX / CY5 ak lòt enstriman PCR fliyoresan milti-chanèl.
Kondisyon pou echantiyon
1. Kalite echantiyon aplikab yo: prelèvman nan gòj, prelèvman nazofarinj, likid lavaj bronchoalveolaire, krache.
2. Koleksyon echantiyon (teknik aseptik)
Prelèvman farinj lan: Siye amidal yo ak miray la farinj dèyè a ak de prelèvman an menm tan, apresa plonje tèt la prelèvman nan yon tib tès ki gen solisyon echantiyon an.
Krache: Apre pasyan an gen yon tous gwo twou san fon, kolekte krache touse a nan yon tib tès bouchon vis ki gen solisyon echantiyon an;likid lavaj bronchoalveolaire: echantiyon pa pwofesyonèl medikal.3.Storage ak transpò echantiyon yo genyen
Yo ta dwe teste espesimèn pou izolasyon viris ak tès RNA yo pi vit posib.Espesimèn ki ka detekte nan lespas 24 èdtan ka estoke nan 4 ℃;sa yo ki pa ka detekte nan 24
èdtan yo ta dwe estoke nan -70 ℃ oswa pi ba (si pa gen okenn kondisyon depo nan -70 ℃, yo ta dwe
tanporèman estoke nan -20 ℃ frijidè).Espesimèn yo ta dwe evite repete konjelasyon ak dekonjle pandan transpò.Yo ta dwe voye echantiyon yo nan laboratwa a pi vit posib apre yo fin kolekte.Si echantiyon yo bezwen transpòte sou distans ki long, yo rekòmande depo glas sèk.
Metòd tès yo
1 Pwosesis echantiyon ak ekstraksyon RNA (zòn pwosesis echantiyon)
Li rekòmande pou pran 200μl echantiyon likid pou fè ekstraksyon RNA.Pou etap ekstraksyon ki gen rapò, al gade nan enstriksyon yo nan twous ekstraksyon RNA komèsyal yo.Tou de negatif ak negatif
kontwòl nan twous sa a te enplike nan ekstraksyon an.
2 PCR preparasyon reyaktif (zòn preparasyon reyaktif)
2.1 Retire tout konpozan nan twous la epi dekonjle epi melanje nan tanperati chanm.Santrifije nan 8,000 rpm pou kèk segond anvan ou itilize;kalkile kantite reyaktif ki nesesè yo, epi sistèm reyaksyon an prepare jan yo montre nan tablo sa a:
| Eleman | N pòsyon (sistèm 25µl) |
| nCOV primer TaqMan probemixture | 18 µl × N |
| Solisyon reyaksyon RT-PCR | 2 µl × N |
| *N = kantite echantiyon yo teste + 1 (kontwòl negatif) + 1 (nCOVkontwòl pozitif) | |
2.2 Apre byen melanje konpozan yo, santrifuje pou yon ti tan pou kite tout likid ki sou miray tib la tonbe nan pati anba tib la, epi apresa aliquot sistèm anplifikasyon 20 µl nan tib PCR la.
3 Echantiyon (zòn pou preparasyon echantiyon)
Ajoute 5μl nan kontwòl negatif ak pozitif apre ekstraksyon.Yo ajoute RNA echantiyon yo pral teste a nan tib reyaksyon PCR la.
Bouche tib la byen sere epi santrifije nan 8,000 rpm pou kèk segond anvan ou transfere li nan zòn deteksyon anplifikasyon an.
4 PCR anplifikasyon (zon deteksyon anplifye)
4.1 Mete tib reyaksyon an nan selil echantiyon enstriman an, epi mete paramèt yo jan sa a:
| etap | Sik nimewo | Tanperati(°C) | Tan | koleksyonsit |
| Ranvèsetranskripsyon | 1 | 42 | 10min | - |
| Pre-denaturasyonn | 1 | 95 | 1min | - |
| Sik | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | 30s | koleksyon done |
Seleksyon chanèl deteksyon enstriman: Chwazi kanal FAM、HEX、CY5 pou siyal fluoresans lan.Pou referans fliyoresan Okenn, tanpri pa chwazi ROX.
5 Analiz rezilta (Tanpri al gade enstriksyon eksperimantal chak enstriman pou mete)
Apre reyaksyon an, sove rezilta yo.Apre analiz, ajiste valè a kòmanse, valè fini, ak valè papòt nan debaz la dapre imaj la (itilizatè a ka ajiste selon sitiyasyon aktyèl la, valè a kòmanse ka mete nan 3 ~ 15, valè a fini ka mete sou. 5 ~ 20, ajisteman) nan graf logaritmik la Nan papòt fenèt la, liy papòt la se nan faz logaritmik la, ak koub anplifikasyon kontwòl negatif la se yon liy dwat oswa anba liy papòt la).
6 Kontwòl Quauty (Yon kontwòl pwosedi enkli nan tès la) Kontwòl negatif: Pa gen koub anplifikasyon evidan pou chanèl deteksyon FAM, HEX, CY5.
COV kontwòl pozitif: koub anplifikasyon evidan nan chanèl deteksyon FAM ak HEX, Ct value≤32, men pa gen okenn koub anplifikasyon nan chanèl CY5;
Kondisyon ki anwo yo dwe satisfè ansanm nan menm eksperyans la;otreman, eksperyans la pa valab epi li bezwen repete.
7 Detèminasyon rezilta yo.
7.1 Si pa gen okenn koub anplifikasyon oswa valè Ct> 40 nan chanèl FAM ak HEX nan echantiyon tès la, epi gen yon koub anplifikasyon nan kanal CY5 la, li ka jije ke pa gen okenn 2019 nouvo coronavirus (2019-nCoV) RNA nan echantiyon an;
.2 Si echantiyon tès la gen koub anplifikasyon evidan nan chanèl FAM ak HEX, epi valè Ct la se ≤40, yo ka jije echantiyon an pozitif pou nouvo coronavirus 2019 (2019-nCoV).
7.3 Si echantiyon tès la gen yon koub anplifikasyon klè sèlman nan yon sèl kanal nan FAM oswa HEX, ak valè Ct la se ≤40, epi pa gen okenn koub anplifikasyon nan lòt kanal la, rezilta yo bezwen yo dwe teste ankò.Si rezilta retest yo konsistan, yo ka jije echantiyon an pozitif pou nouvo a
coronavirus 2019 (2019-nCoV).Si rezilta retès la negatif, yo ka jije echantiyon an negatif pou nouvo coronavirus 2019 (2019-nCoV).
Valè jijman pozitif
Yo itilize metòd koub ROC pou detèmine valè referans CT twous la ak valè referans kontwòl entèn yo se 40.
Entèpretasyon rezilta tès yo
1.Each eksperyans yo ta dwe teste pou kontwòl negatif ak pozitif.Rezilta tès yo ka sèlman detèmine lè kontwòl yo satisfè kondisyon kontwòl kalite
2.Lè chanèl deteksyon FAM ak HEX yo pozitif, rezilta nan kanal CY5 (kanal kontwòl entèn) ka negatif akòz konpetisyon sistèm.
3.Lè rezilta kontwòl entèn la negatif, si chanèl deteksyon FAM ak HEX tib tès la negatif tou, sa vle di ke sistèm nan andikape oswa operasyon an pa bon, tès la pa valab.Se poutèt sa, echantiyon yo bezwen yo dwe teste ankò.
