Pwodwi yo
Twous deteksyon Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR pou 2019-nCoV
Itilizasyon espere
Twous sa a itilize pou deteksyon kalitatif nouvo kowonaviris (2019-nCoV) la lè l sèvi avèk prelèvman gòj, prelèvman nazofarenks, likid lavaj bronchoalveolè, ak krache. Rezilta deteksyon pwodui sa a se sèlman pou referans klinik, epi li pa ta dwe itilize kòm sèl prèv pou dyagnostik ak tretman klinik. Li rekòmande pou fè yon analiz konplè sou kondisyon an ansanm ak manifestasyon klinik pasyan an ak lòt tès laboratwa.
Prensip enspeksyon an
Twous la baze sou teknoloji RT-PCR yon sèl etap. Anfèt, yo te chwazi jèn ORF1ab ak N nouvo kowonaviris 2019 la (2019-nCoV) kòm rejyon sib anplifikasyon yo. Yo fèt amorseur espesifik ak sond fliyoresan (sond jèn N yo make ak FAM epi sond ORF1ab yo make ak HEX) pou detekte ARN nouvo tip kowonaviris 2019 la nan echantiyon yo. Twous la gen ladan l tou yon sistèm deteksyon kontwòl entèn andojèn (sond jèn kontwòl entèn ki make ak CY5) pou kontwole pwosesis koleksyon echantiyon an, anplifikasyon ARN ak PCR, kidonk diminye rezilta fo negatif yo.
Konpozan prensipal yo
| Konpozan | Volim(48T/Twous) |
| Solisyon reyaksyon RT-PCR | 96µl |
| nCOV primer TaqMan probemixture（ORF1ab,N Gene,RnaseP Gene） | 864µl |
| Kontwòl negatif | 1500µl |
| nCOV kontwòl pozitif (l ORF1ab N Gene) | 1500µl |
Reyaktif pwòp: reyaktif pou ekstraksyon ARN oswa pou pirifikasyon. Kontwòl negatif/pozitif: Kontwòl pozitif la se ARN ki gen fragman sib la, alòske kontwòl negatif la se dlo san asid nikleyik. Pandan itilizasyon an, yo ta dwe patisipe nan ekstraksyon an epi yo ta dwe konsidere kòm enfeksyon. Yo ta dwe manipile epi jete yo an akò avèk règleman ki enpòtan yo.
Jèn referans entèn lan se jèn RnaseP imen an.
Kondisyon depo ak dat ekspirasyon
-20 ± 5 ℃, evite repete konjelasyon ak dekonjelasyon plis pase 5 fwa, valab pou 6 mwa.
Enstriman aplikab
Avèk FAM / HEX / CY5 ak lòt enstriman PCR fliyoresan milti-chanèl.
Kondisyon echantiyon yo
1. Kalite echantiyon ki aplikab yo: prelèvman pou gòj, prelèvman pou nazofarenks, likid pou lavaj bronchoalveolè, krache.
2. Koleksyon echantiyon (teknik aseptik)
Presyon farinjyen: Siye amigdal yo ak miray farinjyen posterior la ak de presyon an menm tan, answit plonje tèt presyon an nan yon tib tès ki gen solisyon echantiyon an.
Krache: Apre pasyan an fin touse pwofondman, kolekte krache ki te touse a nan yon tib tès ak bouchon vis ki gen solisyon echantiyon an ladan l; likid lavaj bronchoalveolè: Echantiyonaj la dwe fèt pa pwofesyonèl medikal yo. 3. Depo ak transpò echantiyon yo
Yo ta dwe teste echantiyon pou izolasyon viris ak tès ARN pi vit posib. Espesimèn ki ka detekte nan 24 èdtan yo ka estoke nan 4℃; sa yo ki pa ka detekte nan 24 èdtan
èdtan yo ta dwe estoke nan -70 ℃ oswa anba (si pa gen okenn kondisyon depo nan -70 ℃, yo ta dwe
(Sere tanporèman nan frijidè -20℃). Evite pou yo konjele epi deglase echantiyon yo plizyè fwa pandan transpò. Yo dwe voye echantiyon yo nan laboratwa a pi vit posib apre yo fin kolekte yo. Si yo bezwen transpòte echantiyon yo sou long distans, li rekòmande pou yo estoke yo nan glas sèk.
Metòd Tès yo
1 Pwosesis echantiyon ak ekstraksyon ARN (zòn pwosesis echantiyon)
Li rekòmande pou pran 200μl echantiyon likid pou ekstraksyon ARN. Pou etap ekstraksyon ki gen rapò ak yo, gade enstriksyon twous ekstraksyon ARN komèsyal yo. Tou de echantiyon negatif ak negatif yo
Kontwòl ki nan twous sa a te enplike nan ekstraksyon an.
2 Preparasyon reyaktif PCR (zòn preparasyon reyaktif)
2.1 Retire tout konpozan yo nan twous la epi deglase yo epi melanje yo nan tanperati chanm. Santrifije a 8,000 rpm pandan kèk segonn anvan ou itilize li; kalkile kantite reyaktif ki nesesè yo, epi prepare sistèm reyaksyon an jan yo montre nan tablo ki anba la a:
| Konpozan | Pòsyon N (sistèm 25µl) |
| nCOV primer TaqMan probemixture | 18 µl × N |
| Solisyon reyaksyon RT-PCR | 2 µl × N |
| *N = kantite echantiyon teste + 1 (kontwòl negatif) + 1 (nCOV)kontwòl pozitif) | |
2.2 Apre ou fin byen melanje konpozan yo, santrifije yo pou yon ti tan pou tout likid ki sou miray tib la tonbe nan fon tib la, epi answit mete 20 µl sistèm anplifikasyon an nan tib PCR la.
3 Echantiyonaj (zòn preparasyon echantiyon)
Ajoute 5μl nan kontwòl negatif ak pozitif yo apre ekstraksyon an. Ajoute ARN echantiyon an pou teste a nan tib reyaksyon PCR la.
Bouchon tib la byen sere epi santrifije li a 8,000 rpm pandan kèk segond anvan ou transfere li nan zòn deteksyon anplifikasyon an.
4 Anplifikasyon PCR (zòn deteksyon anplifye)
4.1 Mete tib reyaksyon an nan selil echantiyon enstriman an, epi mete paramèt yo jan sa a:
| sèn | Sik nimewo | Tanperati(°C) | Tan | koleksyonsit |
| Ranvèsetranskripsyon | 1 | 42 | 10 minit | - |
| Pre-denaturasyonn | 1 | 95 | 1 minit | - |
| Sik | 45 | 95 | 15 segonn | - |
| 60 | 30s | koleksyon done |
Seleksyon chanèl deteksyon enstriman an: Chwazi chanèl FAM, HEX, CY5 pou siyal fliyoresans lan. Pou referans fliyoresans NONE, tanpri pa chwazi ROX.
5 Analiz rezilta (Tanpri gade enstriksyon eksperimantal chak enstriman pou konfigirasyon)
Apre reyaksyon an, sove rezilta yo. Apre analiz la, ajiste valè depa a, valè final la, ak valè papòt liy debaz la dapre imaj la (itilizatè a ka ajiste selon sitiyasyon reyèl la, valè depa a ka mete sou 3 ~ 15, valè final la ka mete sou 5 ~ 20, ajisteman) nan graf logaritmik la. Nan papòt fenèt la, liy papòt la nan faz logaritmik la, epi koub anplifikasyon kontwòl negatif la se yon liy dwat oswa anba liy papòt la).
6 Kontwòl kalite (Yon kontwòl pwosedi enkli nan tès la) Kontwòl negatif: Pa gen okenn koub anplifikasyon evidan pou chanèl deteksyon FAM, HEX, CY5 yo.
Kontwòl pozitif COV: koub anplifikasyon evidan nan chanèl deteksyon FAM ak HEX, valè Ct ≤32, men pa gen koub anplifikasyon nan chanèl CY5 la;
Kondisyon ki anwo yo dwe satisfè an menm tan nan menm eksperyans lan; sinon, eksperyans lan pa valab epi li bezwen repete.
7 Detèminasyon rezilta yo.
7.1 Si pa gen okenn koub anplifikasyon oswa valè Ct > 40 nan chanèl FAM ak HEX echantiyon tès la, epi gen yon koub anplifikasyon nan chanèl CY5 la, yo ka jije ke pa gen okenn ARN nouvo kowonaviris 2019 (2019-nCoV) nan echantiyon an;
.2 Si echantiyon tès la gen koub anplifikasyon evidan nan chanèl FAM ak HEX yo, epi valè Ct a ≤40, yo ka jije ke echantiyon an pozitif pou nouvo kowonaviris 2019 la (2019-nCoV).
7.3 Si echantiyon tès la gen yon koub anplifikasyon klè sèlman nan yon sèl kanal FAM oswa HEX, epi valè Ct a ≤40, epi pa gen okenn koub anplifikasyon nan lòt kanal la, rezilta yo bezwen teste ankò. Si rezilta tès yo konsistan, echantiyon an ka jije pozitif pou nouvo a.
kowonaviris 2019 (2019-nCoV). Si rezilta tès la negatif, yo ka jije echantiyon an negatif pou nouvo kowonaviris 2019 la (2019-nCoV).
Valè jijman pozitif
Metòd koub ROC la itilize pou detèmine valè CT referans twous la epi valè referans kontwòl entèn lan se 40.
Entèpretasyon rezilta tès yo
1. Yo ta dwe teste chak eksperyans pou kontwòl negatif ak pozitif. Rezilta tès yo ka sèlman detèmine lè kontwòl yo satisfè egzijans kontwòl kalite yo.
2. Lè chanèl deteksyon FAM ak HEX yo pozitif, rezilta ki soti nan chanèl CY5 la (chanèl kontwòl entèn) ka negatif akòz konpetisyon sistèm lan.
3. Lè rezilta kontwòl entèn lan negatif, si chanèl deteksyon FAM ak HEX tib tès la negatif tou, sa vle di sistèm nan enfim oswa operasyon an pa bon, tès la pa valab. Se poutèt sa, echantiyon yo bezwen teste ankò.
